Q:

基因槍的原理為何?

A:

簡單的說就是利用壓力,將DNA 打入細胞中。以PDS-1000 基因槍為例(參照下圖):將建構好帶有特定DNA片段的質體(plasmid),附著在微小的粒子(microcarrier)上,如金粒子,將此附有DNA的金粒子塗在macrocarrier 上,選擇適當的壓力膜(rupture disk),當氣體衝出時,會將macrocarrier 打出,在macrocarrier 前方,有網狀的停止簾(stopping screen),會阻擋macrocarrier ,只有金粒子會通過,射入下方準備好的 sample 中。上述整組裝備,包含sample 都裝置在一可密閉的chamber 中,在每次轟擊之前,先將此chamber 抽氣至適當真空度,以降低金粒子在空氣中的阻力。

Q:

打基因槍時,DNA 的大小有無限制?
A:

plasmid 或是 naked DNA 片段大小在 20-25 kb 以內都可以 
Q:

打基因槍時,如何選擇適當的 particles?
A:

(1) 目前有兩種 particles 可供選擇,分別為金粒及 鎢粒, 鎢粒子較小也較便宜,但形狀不規則,且對某些細胞而言具有毒性。金粒子呈圓球形,且大小均勻,因此本實驗室在經費許可下提供金粒子。

(2) 使用 particles 的大小則根據細胞或組織的特性調整,particles 越大速度及穿透力也越大。

Q:

打基因槍時,有哪些參數可以調整?  
A:

考慮因素包括粒子對細胞的穿透力,細胞大小,組織結構等等因素。可根據使用的材料調整以下因子

(1) 粒子的大小

(2) sample 與 macrocarrier 之間的距離

(3) 壓力

(4) 真空度(真空度越高,穿透力越大)

Q: 在種植阿拉伯芥時若發生真菌感染時該如何處理?
A: (1) 隔離感染植株,以免感染其他健康植株

(2)若為已知病原菌可依據該病原菌施藥,若為介質上所長之真菌,建議施用亞托敏,稀釋2000倍,直接加在介質上

(3)為防止真菌發生,應盡量保持生長箱乾淨;介質使用前先滅菌;不要的植株或土、盆等物,立即清理乾淨

Q: EHA105要養在什麼條件下?
A: YEP LB media 5 mg/L rifampicin28℃下培養。EHA105 C58 background加上 pTiBo542ΔT-DNA。其中Ti plasmid 上並沒有selection markerrifampicin resistant gene 是在染色體上。請注意不要將 rifamycin rifampicin 搞混了!
Q: 我想要轉殖番茄,該使用哪一個Agrobacterium strain
A:

各物種常用的農桿菌菌株,請參考下表

轉殖物種

使用農桿菌

培養使用抗生素及其濃度

 

阿拉伯芥

GV3101

Gentamycin 50mg/L

溶液

菸草

LBA4404

Streptomycin 25mg/L

水溶性, 過濾消毒

番茄

LBA4404

Streptomycin 25mg/L

水溶性, 過濾消毒

水稻

EHA101

Kanamycin 50mg/L

水溶性, 過濾消毒

EHA105

Rifampicin 5mg/L

溶解在DMSO中, 不需再過濾

 

Q:

在進行農桿菌感染前應該注意哪些事?

A:

 1. 在選擇 vector 時,需考慮的因子包括:

· 實驗的目的,包括 gene taggingpromoter or enhancer trappingconstitutive expression or regulated expressiontransgene sizeflanking sequences analysis or not 等等。

· transgene 的數量:多個基因轉進同一個 line 中(transgene stacking),要用雜交方式將不同轉殖株的基因導入同一個line,或者要經過數次轉殖過程,在選擇 selection marker 時就必須要先計畫好。

· 轉殖植物篩選時,該物種適用的selection marker

· 同一個 constructs,要轉殖到幾種不同的物種的話,是否都可適用

參考文獻:R. Hellens, P. Mullineaux and H. Klee 2000 Trends in Plant Science 5(10):446-451

2. 將 plasmid建構好, 需檢測的項目包括:

· transgene 序列是否正確無誤(定序)

· insert 的方向是否正確(restriction enzyme fragment

3. 將plasmid送入Agrobacterium 時需注意

· 依據host 的種類決定agrobacterium strain,各物種常用的農桿菌菌株,請參考下表

轉殖物種

使用農桿菌

培養使用抗生素及其濃度

 

阿拉伯芥

GV3101

Gentamycin 50mg/L

溶液

菸草

LBA4404

Streptomycin 25mg/L

水溶性, 過濾消毒

番茄

LBA4404

Streptomycin 25mg/L

水溶性, 過濾消毒

水稻

EHA101

Kanamycin 50mg/L

水溶性, 過濾消毒

EHA105

Rifampicin 5mg/L

溶解在DMSO中, 不需再過濾

 

· 養成 competent cell之前,先進行 keto-lactose test 確認農桿菌。

· competent cell culture 時需加入適當抗生素,以便維持 helper vector

· transform 後,至少挑取2-3 single colonies,進行PCR確認。

· 將確認過正確無誤的 colony 養成broth,加入15glycerol 製成 stock(可製成多管備用),保存在-70℃下備用。回溫超過三次即丟棄不用。

4. 感染使用的菌需注意:

· -70℃保存的 stock 劃菌,養在28℃下,2天後可長出single colony(注意劃菌時,沾菌的接種環要燒過或換新的,再接著劃,以便確實劃出 single colony) 。

· 請注意是否有其他雜菌的汙染,若在plate上養出其他的菌,則另外取一管新的stock。

· 勿使用重覆劃成的plate

· 勿使用超過3週的plate

· 養菌時需加入適當抗生素,包括 helper vector binary vector 需要的selection markers。各種菌株使用抗生素如下表:

農桿菌菌株

培養使用抗生素及其濃度

 

GV3101

Gentamycin 50mg/L

溶液

LBA4404

Streptomycin 25mg/L

水溶性, 過濾消毒

EHA101

Kanamycin 50mg/L

水溶性, 過濾消毒

EHA105

Rifampicin 5mg/L

溶解在DMSO中, 不需再過濾

5. 感染時需注意事項:

· 菌液通常在28℃下培養 over night,若菌液太稀(OD600<1.0)則表示菌的活性太差,從另一管stock 中劃菌,以新鮮的菌養成 broth

· 感染時的溫度需控制在30℃以下。

· 注意感染時的菌液濃度(常用的濃度為 OD600=0.6-0.8,在此濃度下感染,通常需要 wash),菌液體積與 explants 的數量等因子。依據不同植物不同方法而略有差異。

· 需選擇健康狀況良好的植物作為轉殖對象。植物的狀態對於轉殖率有相當關鍵的影響。

 
Q: 為什麼我的農桿菌養不出來
A:

推測可能的原因:

1. 抗生素用錯。這是最常見的原因,也是最容易解決的問題。先檢查一下你所選的Agrobacterium strain。接著檢查 plasmid map。換成正確的抗生素,並且驗算一下使用的濃度是否正確。

2. 菌活性不好。可能是stock 回溫太多次,在劃成 plate 時就不不容易長。換一瓶stock 即可。

3. incubator 的溫度異常。

4. media 是否配錯。(用另一菌株當作 control養養看即可知道)

5.忘記開shaker,或轉速不夠。

6. 若不是上述原因,則重新transform 一次。

 
Q: 請問轉殖阿拉伯芥,送菌後須等多久可以收到種子?
A: 感染後約2個月後可以收到種子。屆時轉殖室將會電話通知。
Q:

請問轉殖菸草,送菌後須等多久可以收到轉殖株?

A:

不同的selection marker 需要的時間略有不同。以kanamycin 篩選者,感染後約2個月後將陸續交還 putative transformants;以 hygromycin篩選者,則較耗時,感染後約3個月後將陸續交還 putative transformants。屆時轉殖室將會電話通知。

 

Q: 請問轉殖番茄,送菌後須等多久可以收到轉殖株?
A:

不同的selection marker 需要的時間略有不同。以kanamycin 篩選者,感染後約2個月後將陸續交還 putative transformants;以 hygromycin篩選者,則較耗時,感染後約3個月後將陸續交還 putative transformants。屆時轉殖室將會電話通知。

 

Q: 請問轉殖水稻,送菌後須等多久可以收到轉殖株?
A: 感染後約3個月後交還 putative transformants。屆時轉殖室將會電話通知。
Q: 請問轉殖室是以哪一種水稻為材料進行轉殖?
A: 轉殖室使用的水稻是 Oryza sativa cv. TN67
Q: 請問轉殖室是以哪一種菸草為材料進行轉殖?
A: 轉殖室使用的菸草是 Nicotiana tobacum W38
Q: 請問轉殖室是以哪一種阿拉伯芥為材料進行轉殖?
A: 轉殖室使用的阿拉伯芥是 Arabidopsis thialiana ecotype columbia
Q: 請問轉殖室是以哪一種番茄為材料進行轉殖?
A: 轉殖室使用的番茄是 Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom
Q: 是否可以申請以不同品種(或不同種)的菸草進行轉殖?
A:

可以。須由申請之實驗室提供種子。從播種開始,到長出成熟展開的葉片約需花費2個月(視品種而定),此時的葉片方可進行感染。較一般轉殖室程序多出2個月左右。需要的實驗請先計畫好,提早申請。

Q:

是否可以申請以不同品種的番茄進行轉殖?

A:

番茄的轉殖,不同品種之間差異甚大,包括培養所使用的維生素和賀爾蒙都有不同,所以若要進行不同品種的轉殖較困難。

Q:

是否可以申請以不同 ecotype的阿拉伯芥進行轉殖?

A:

可以。須由申請之實驗室提供種子。同時請申請的實驗室,在申請時詳細說明該植物的栽培條件及生長速度等相關資訊。由於進行轉殖感染的植物大小有一定的範圍,申請的實驗室務必在已準備好農桿菌的情況下方可申請。

Q:

是否可以申請以不同品種的水稻進行轉殖?

A:

可以(但僅限於Japonica)。須由申請的實驗室提供品質良好的種子。水稻轉殖時,使用由成熟種子胚誘導的 embryogenic calli,作為感染材料;種子的品質將決定 calli 感染後的生長狀態及轉殖率。因此轉殖室在收到種子後,會篩選符合條件的種子,進行後續工作。

Q:

為什麼表面消毒阿拉伯芥轉殖過收集的種子,播種後仍會發生污染?

A:

請先觀察一下是哪一種污染。如果是農桿菌污染,可以在播種的media 中加入200mg/L timentin,即可見效。如果是其他細菌或真菌汙染,則可能是消毒方法或操作過程所導致的汙染。可參考轉殖室的方法:轉殖阿拉伯芥篩選。同時在準備時注意各項器械及用具的消毒,操作時小心注意。

Q: 請問以抗生素篩選轉殖種子時,非轉殖株的種子會不會發芽?
A:

會的!只不過會在萌發後,第一對真葉長出來前後,停止繼續發育而死亡。若種子不會萌發,有幾個可能的原因:

1. 漂白水沒有洗乾淨。以大量無菌水多洗幾次即可。或者消毒過程有問題,例如,漂白水濃度過高、消毒時間過長等等。

2. 播種時使用0.1 agarose 溫度過高。將配好且滅過菌的agarose分裝約一次使用的量,使用前加熱至溶解後,置於40℃水浴槽,待溫度平衡即可使用。

3. 沒有經過低溫打破休眠。消毒種子後,將種子浸在無菌水中,放在4℃冰箱約1-3天之後,再無菌播種即可。

4. 種子放太久,且並未保存在適當條件。通常在種子收取後幾天之內進行篩選工作,可以得到超過95%的萌發率。若需長時間保存種子的話,需保存在低溫乾燥的條件下(可以將種子放在有乾燥劑的密封罐中,將此密封罐保存在4℃冰箱,以此條件保存一年後,仍可維持70-80%萌發率)。

Q: 請問以抗生素篩選轉殖種子時,該如何分辨何者是轉殖株?
A:

若是將種子播在1/2MS + 1 sucrose media 中(播種後置於4℃冰箱2天),培養在24℃生長箱條件下,大約10-14天左右可以觀察到,大多數種子已經萌發,其中可以看到有一些真葉已長出來,且明顯較大棵的植物。仔細近看可以發現,這些植株的根系發育良好,這些就是putative transformants。(參考圖24-1,24-220mg/L hygromycin selection,播種後二週)

   Fig 24-1

   Fig 24-2

Q: 為什麼我的阿拉伯芥轉殖率很低?
A:

一、影響轉殖率的因子,可以從兩個方面來探討。第一是感染時使用的植物,第二是農桿菌。分別說明如下:

1. 植物:需選擇生長狀況良好的植物,可以觀察葉片顏色、數量及大小來判斷。感染時的植株大小,選擇花序長度介於10-15公分之間的植株。在感染的前一天,充分澆水。在收取種子時,秤重估算種子數量,以此判斷感染後植物的生長是否正常(通常感染過的植物每棵可收得0.03g – 0.2g)。

2. 農桿菌:選用適當菌株(建議使用 GV3101)。進行 keto-lactose test檢測農桿菌。將 plasmid transform 到農桿菌後,挑取數個single colony,以PCR 確認plasmid之存在。使用新鮮劃成而且具有single colonies plate。養成 broth 之後,以OD600讀值來判斷菌的活性(約介於1.0-2.2之間)。

二、植物及農桿菌的狀況若都符合上述條件,可是轉殖率仍然很低,則有其他可能性,例如:

1. 感染過程中發生的問題。感染時使用的media 是否有加入適當濃度的 sucrosesilwet L-77 BA(已有實驗證明此三項物質對轉殖率有影響)。感染時的溫度。

2. 篩選過程中發生的問題。計算種子的萌發率,同時播一些 wild type 的種子,在篩選的media 上,以便檢查此過程。可參考轉殖室的篩選方法:轉殖阿拉伯芥篩選,或者參考文獻Arabidopsis protocol2006Totowa, N.J. : Humana Press。(其他相關的問題參照種子不萌發)

3. 實驗設計上的問題。例如transgene 是否會影響種子萌發或植物的生長發育等等。

 
Q: 在進行 histochemical GUS assay 時需注意哪些事?
A:

1. substrate buffer 製備:建議使用新鮮配製的 buffer。若非新鮮配製,最好同時有一組 positive control,以便偵測buffer 是否仍有效。

2. 評估實驗需求,sample是否要進行固定。通常反應時間大約是 overnight。若是使用的prormoter 會受到一些因子調控,例如光照、缺氧、osmolarity或者是 phosphate 等等,則建議先固定組織或同時培養在不同條件下作為對照。

3. 若是染花或果實等器官,則建議加入 10-100 mM ascorbate,防止顏色變褐。

4. 由於使用的promoter強度不同,反應的速度與添加的 substrate 濃度有關。建議在染色開始之後的四小時內,每15分鐘觀察一次;之後則是16小時後觀察。

5. 在某些物種的花及果實,具有native GUS activity,在進行反應時,可將 buffer pH 值調成7-8,或加入10-20 methanol

參考文獻:GUS protocolsusing the GUS gene as a reporter of gene expreesion1992San Diego : Academic Press